豬細(xì)小病毒(PPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)

通用名稱：豬細(xì)小病毒(PPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)

Name ：Porcine Parvovirus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus, PPV）是引起母豬流產(chǎn)和新生仔豬死亡的主要病原體之一，同時(shí)也能引起某些皮膚病和腹瀉[1-2]，嚴(yán)重影響豬群的健康和正常生產(chǎn)，己經(jīng)給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。本病主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎，母豬通常不表現(xiàn)臨床癥狀。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 將常規(guī) PCR 技術(shù)與熒光檢測(cè)相結(jié)合,不僅具有敏感性高、特異性強(qiáng)、用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn),而且通過(guò)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，結(jié)果更為準(zhǔn)確直觀, 已成為病原體檢測(cè)的重要方法[3]。

本試劑盒適用于檢測(cè)腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、腎、肺、肝、腦、睪丸、胎盤的肺和淋巴結(jié)、全血等樣本中的豬細(xì)小病毒，用于豬細(xì)小病毒感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)豬細(xì)小病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針， 用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)豬細(xì)小病毒的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

疑似感染仔豬取腸系膜淋巴結(jié)或肝臟；流產(chǎn)或死胎的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤肺、淋巴結(jié)等組織；待檢   活豬，用注射器取血 5mL

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)/剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清 100μL 于滅菌離心管中。

1.2  核酸提取

推薦采用公司生產(chǎn)的 DNA/提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操

作。

2.  試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1  將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及 Threshold的 Value 值（上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照），重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；

可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線， 判定為陽(yáng)性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7.  檢測(cè)方法的局限性

1. 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2. 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

3. 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

4. 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7. 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，混勻并短暫離心；

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]  Mengeling W L. Prevalence of porcine parvovirus induced reproductive; an abattoir study [J]. Am Vet Med Assoc, 1978, 172: 1291-1294.

[2]  Den S. Parvovirus-like particle associated with diarrhea in unweaned piglets [J]. Can Comp Med, 1985, 49: 343-345. [3]殷 震,  劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M] . 2 版.  北京: 科學(xué)出版社, 1997.

[4] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1919-2016 豬細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范[S].